细胞迁移与侵袭实验，是评估肿瘤转移、伤口愈合、免疫细胞浸润等过程的经典实验。但在实际操作中，很多人的结果却“拿不出手”：划痕宽窄不一、细胞没爬过去；Transwell穿膜细胞染色斑驳不均；拍照很漂亮，量化全是凭感觉……

这些问题往往不是细胞本身的问题，而是实验原理理解不到位，操作细节没控制住。皮诺飞生物细胞平台结合多年项目经验，把迁移与侵袭实验的5个核心环节拆开讲透——划痕实验、Transwell迁移、Transwell侵袭（铺胶）、染色与拍照、数据量化与分析——帮你从源头做出漂亮、可量化的数据。

皮诺飞生物细胞实验

【01 划痕实验（Wound Healing）：简单但不随便】

划痕实验是检测细胞二维平面迁移能力最直观的方法。核心是制造一个无细胞的“空白区”，观察细胞在一定时间内向空白区移动的速度。

操作要点：

• 细胞铺板：实验前一天铺板，确保第二天细胞达到90%-100%融合度（单层贴壁）。

• 制造划痕：使用200μL无菌枪头，借助直尺，在孔板底部垂直、均匀地划出“井”字或平行线。

• 洗涤：用PBS轻轻洗涤2-3次，彻底洗去脱落的细胞和碎片，避免它们贴回划痕区。

• 培养：加入无血清或低血清（1%-2%）培养基，避免细胞增殖干扰迁移结果。

• 拍照：在0h、6h、12h、24h（根据细胞迁移速度定）固定时间点、同一位置拍照。

关键提醒： 划痕实验最大的痛点是“人为误差”。建议固定同一个人操作，每组至少划3条线，并标记位置以保证每次拍照是同一视野。

【02 Transwell迁移实验：三维空间下的“钻膜”】

Transwell迁移实验利用聚碳酸酯膜（通常孔径为8μm）分隔上下室，检测细胞在趋化因子诱导下，穿过微孔膜的能力。

操作要点：

• 小室准备：将Transwell小室放入24孔板中。下室加入含10%-20% FBS的完全培养基（作为趋化诱导）。

• 细胞接种：上室加入100-200μL 无血清培养基重悬的细胞（通常1×10⁴ - 1×10⁵/孔）。注意：上室严禁出现气泡。

• 培养：37℃培养12-48h。

• 固定与染色：取出小室，甲醇固定，结晶紫染色。

• 擦拭：用棉签轻轻擦去上室未穿膜的细胞（关键步骤）。

关键提醒： 上下室的血清浓度梯度是诱导迁移的核心动力。若上下室血清浓度一致，细胞将随机运动，失去实验意义。

【03 Transwell侵袭实验：跨越“基质胶”屏障】

侵袭实验与迁移实验操作几乎一致，唯一的区别在于：上室膜表面需要预先铺一层基质胶（Matrigel），模拟细胞外基质（ECM）。细胞必须先分泌酶降解基质胶，才能穿过微孔膜。

操作要点：

• 铺胶：将Matrigel用预冷无血清培养基按比例（如1:8）稀释，取50-100μL加入上室，37℃凝固30min以上。

• 水化：铺胶后，可加入少量无血清培养基水化数分钟。

• 后续操作：与迁移实验完全一致（接种无血清细胞，下室加含血清培养基，后续固定、染色、擦拭）。

关键提醒： Matrigel在室温下会迅速凝固，操作必须迅速且在冰上进行，否则会堵塞枪头，导致铺胶失败。

【04 染色与拍照：让结果“好看”】

结果呈现直接影响读者的直观感受，必须做到背景干净、细胞形态清晰、对比明显。

染色方法：

• 结晶紫染色（最常用）：0.1%结晶紫室温染色10-15min，PBS洗去多余染料。

• DAPI/HE染色：如需观察细胞核或形态，可使用荧光或苏木素染色。

拍照规范：

• 划痕：使用倒置显微镜（4x或10x物镜），每天同一位置拍照。

• Transwell：用镊子小心夹取小室边缘，在显微镜下随机选取5-10个视野（中心+四周）拍照。

关键提醒： Transwell拍照前，务必将膜上的水分吸干，否则反光会导致细胞模糊不清。

【05 数据量化与分析：告别“凭感觉”】

只有客观的量化数据，才能进行统计学分析。

划痕量化（ImageJ）：

• 使用ImageJ的“Wound Healing Size Tool”或手动测量工具，测量不同时间点的无细胞面积。

• 愈合率（%）=（初始面积 - 测量时间点面积）/ 初始面积 × 100%。

Transwell量化（ImageJ）：

• 使用ImageJ的“Cell Counter”插件，手动或半自动计数染色的细胞数。

• 取5-10个视野的平均值，作为该复孔的穿膜细胞数。

关键提醒： 量化时必须盲法计数，即处理样本的人不能是拍照和计数的人，以排除主观偏差。

【06 常见问题快查】

【结语】

细胞迁移与侵袭实验，看似操作简单，实则处处是坑。从划痕的匀称度、Transwell的血清梯度、铺胶的平整度，到擦拭手法、拍照定位、盲法定量，每一个环节都决定了数据的成败。掌握了这套技术规范，你的迁移侵袭实验将不再是“玄学”。