细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒

一、产品组分与包装规格

爬片 β-半乳糖苷酶（不染核）

小鼠肾冰冻切片 β-半乳糖苷酶（染核）

二、产品简介

细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Senescence β-Galactosidase Staining Kit)，基于衰老细胞特异性高表达的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性实现细胞、组织衰老染色检测，普通光学显微镜即可直观观察细胞衰老状态。

适用样本：贴壁培养细胞、悬浮细胞、冰冻组织切片；不推荐直接用于石蜡切片检测。

正常体细胞分裂存在次数上限，增殖停滞后进入衰老状态。细胞仍保持存活，但基因、蛋白表达谱发生显著改变，无法被常规刺激诱导分裂，细胞周期特征区别于损伤休眠、细胞接触抑制。衰老细胞通常体积膨大，可特异性表达pH 6.0条件下具备高活性的β-半乳糖苷酶。细胞衰老既是机体抑制肿瘤发生的内源机制，也是生物体老化进程的核心标志物。

三、储存与运输条件

• 整体储存条件：-20℃避光保存，有效期12个月；

• 特殊试剂要求：X-Gal溶液全程避光存放；

• 溶解说明：低温存放后X-Gal会凝固，室温或37℃水浴2–5分钟充分摇晃即可完全溶解。

四、染色工作液标准配制体系

配置提示：全部试剂混合后充分震荡混匀，无可见沉淀后方可使用。

五、详细实验操作步骤

1. 贴壁细胞（以6孔板为标准参照）

1. 吸除细胞培养液，PBS或HBSS洗涤1次；每孔加入1mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15分钟。其他规格培养板可按体积比例等比缩放试剂用量。

2. 吸除固定液，使用PBS/HBSS漂洗细胞3次，每次浸泡3分钟。

3. 彻底吸干缓冲液，每孔加入1mL现配染色工作液。

4. 保鲜膜/封口膜密封孔板防止液体蒸发，37℃恒温孵育过夜；严禁放入CO₂细胞培养箱孵育。

5. 光学显微镜观察与样本保存：

• 短期保存：弃去染色工作液，每孔添加2mL PBS，4℃可存放数天；

• 长期保存：封片液封片处理后，4℃可长期留存；

• 结晶处理：若产生结晶干扰观测，使用70%乙醇漂洗溶解结晶，再更换PBS，不影响最终染色效果。

2. 悬浮细胞

1. 1.5mL离心管收集细胞沉淀，PBS/HBSS洗涤1次；加入1mL固定液，室温摇床低速摇晃固定15分钟，避免细胞团聚结块。

2. 离心去除固定液，PBS/HBSS漂洗3次，每次3分钟。

3. 吸干缓冲液，每离心管添加0.5–1mL染色工作液。

4. 37℃环境孵育过夜，禁止使用CO₂培养箱。

5. 涂片观察及保存：

• 临时保存：离心弃染色液，加入1mL PBS，4℃短期存放；

• 长期保存：细胞涂片封片后置于4℃保存；

• 结晶处理：出现结晶可采用70%乙醇洗涤去除。

3. 冰冻组织切片

1. 切片室温复温，PBS浸泡洗涤组织3次，单次浸泡不少于5分钟。

2. 加入足量固定液完全覆盖组织样本，室温固定不少于15分钟。

3. PBS浸泡洗涤组织3次，单次浸泡≥5分钟。

4. 吸干表面缓冲液，添加足量染色工作液完全浸没切片组织。

5. 封口膜密封防蒸发，37℃孵育过夜，不可放入CO₂培养箱。

6. 封片后4℃保存，普通光学显微镜观察；产生结晶可使用70%乙醇浸泡清洗去除。

六、实验关键注意事项

安全操作警示：β-半乳糖苷酶染色固定液具备毒性与腐蚀性，全程佩戴手套、口罩进行操作，避免皮肤直接接触或吸入挥发气体。

1. 结晶消除方案：孵育后溶液蒸发易析出结晶干扰拍照观察，吸净染色液后用70%乙醇短时间浸泡溶解结晶，更换PBS即可，不会破坏染色信号。

2. 石蜡切片限制：石蜡包埋高温、固定处理流程会造成β-半乳糖苷酶失活，极易染色失败；若必须用于石蜡切片实验，需自行优化整套实验条件。

3. 试剂溶解规范

• X-Gal低温易凝固，水浴融化并充分摇匀后再使用；

• 染色液B管底少量沉淀属于正常现象，涡旋震荡至完全溶解后方可取用；

• 配制工作液时若出现絮状沉淀，充分震荡完全溶解后再进行加样。

4. 孵育环境要求：CO₂培养箱内高浓度二氧化碳会改变染色工作液pH值，直接造成染色完全失效，全程需在无CO₂ 37℃恒温环境孵育。

5. 96/48孔板边缘效应规避方法

• 适当缩短孵育时长，减少液体蒸发；

• 舍弃外围边缘孔，空置孔填充纯水或PBS；

• 多孔板凹槽内加水保湿，搭配防挥发盖板；

• 整块培养板放置湿盒内孵育；

• 实验样本随机排布，避免分组集中边缘孔产生系统误差。

6. 自备耗材：实验操作需自行准备PBS缓冲液或HBSS平衡盐溶液。

本试剂盒仅用于科学科研实验，不可用于人体临床诊断检测