自噬（Autophagy）是真核细胞中高度保守的溶酶体依赖性降解途径，核心作用是维持细胞稳态、应对代谢应激、清除损伤细胞器，也是肿瘤、神经退行性疾病等研究的重要靶点。简单来说，自噬过程中会形成双层膜的自噬体，包裹受损线粒体、错误折叠蛋白等，再与溶酶体融合降解，实现物质循环利用；营养缺乏、氧化应激等刺激会显著诱导自噬活性。而我们用到的MDC（单丹磺酰尸胺），是一种嗜酸性荧光染料，能特异性标记细胞内的酸性囊泡（最典型的就是自噬体）。因自噬体内部呈酸性（pH 4.5-5.5），弱碱性的MDC可进入并结合，在激发波长335-380 nm、发射波长500-540 nm下发出绿色荧光，且荧光强度与自噬体数量正相关——通过荧光显微镜观察或流式细胞仪定量，就能快速评估细胞自噬水平。重点提醒：MDC法仅适用于培养的活细胞/组织，不能用于冻存、固定的细胞、组织及切片染色！ |
提前备好以下仪器和试剂，避免实验中途手忙脚乱，所有试剂建议提前检查有效期～• 仪器：荧光显微镜/共聚焦显微镜、CO₂细胞培养箱、超净工作台、倒置显微镜、离心机、移液器、细胞培养板• 试剂：基础培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶-EDTA、MDC试剂取对数生长期细胞，消化计数后，接种于含细胞爬片的24孔板，放入CO₂培养箱中培养24 h，确保细胞贴壁（细胞状态越好，实验结果越准确）。• 模型组：用PBS处理2 h（可根据自身实验需求调整干预条件）将MDC（1000×）原液，按1:1000的比例用Assay Buffer稀释为MDC（1×），即我们后续要用的「MDC染色液」，配制后避光保存。- 吸去培养板中的培养基，用PBS轻轻清洗细胞1-2次，彻底去除残留血清和药物（避免干扰染色）。
2. 每孔加入1 mL MDC染色工作液，放入细胞培养箱，37℃避光孵育30 min（可根据染色效果，在10-60 min内适当调整孵育时间）。3. 孵育结束后，吸去MDC染色液，用PBS轻轻清洗细胞2-3次，最后每孔加入2 mL PBS，准备观察。在荧光显微镜下观察细胞，找到发出绿色荧光的亮点（即自噬体），拍照记录实验结果即可。以SUM-159PT细胞为例：经PBS处理2 h后，MDC染色可在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光亮点，这就是细胞发生自噬的特征性变化，可根据荧光强度和亮点数量，初步判断自噬水平。
五、注意事项（必看！避免实验失败）
MDC染料对光照极度敏感，从染液配制、染色孵育到观察拍照，全程必须严格避光，否则会导致荧光淬灭，影响实验结果。染色结果受细胞密度、融合度和活性影响极大：所有实验组需保持一致的铺板密度；尽量在细胞对数生长期进行检测；死细胞会产生非特异性背景信号，需提前排除。MDC最佳孵育时间因细胞类型不同而有差异，建议提前做预实验，选择“荧光信号最强、背景最低”的时间点；孵育过长会导致染料在非酸性囊泡蓄积，增加背景干扰。①洗涤时动作要轻，沿孔壁缓慢加液、吸液，避免冲击细胞层导致细胞脱落；②洗涤要充分，未结合的MDC会产生背景荧光，影响定量准确性。再次强调：MDC法只能用于培养的活细胞/组织检测，不能用于冻存、固定的细胞、组织及切片，否则无法获得有效结果。以上就是MDC法检测细胞自噬的完整教程啦，收藏起来，下次做实验直接对照操作～若有实验细节疑问，可在评论区留言交流哦！
